Ano ang maaaring problema kung ang banda ay hindi lumilitaw sa Western Blot?

Sagot:

Maraming …

Paliwanag:

Maraming mga kadahilanan kung bakit ang mga banda ay hindi maaaring lumitaw sa isang western blot. Nakarating na ang mga sample at mga kumbinasyon ng antibody sa nakaraan?

Nasa ibaba ang ilan lamang na maaari kong isipin sa sandali na maaaring maging sanhi ng mga banda na hindi lilitaw:

1. Ibig ba ang paglipat ng protina mula sa gel? Subukan ang paglamay sa lamad sa isang bagay tulad ng ponceau S o amido na itim upang makita kung ang mga banda ay naroroon. Kung minsan, maaari mong makita ang mga protina na banda sa lamad sa pamamagitan ng pag-basa ito at hawak ito sa anggulo sa liwanag.

2. Ang pangunahing antibody ay gumagana? Ito ay isang matigas upang subukan at ang tanging paraan na maaari mong ay sa pamamagitan ng pagsasama ng isang positibong kontrol kung saan alam mo mayroon kang ang protina ng interes kasalukuyan. Kung mayroon kang ilan sa mga protina ng interes maaari mong subukan spotting ito papunta sa Western blotting lamad (ibig sabihin hindi mo patakbuhin ang gel) at nakakakita kung makakuha ka ng isang resulta kung iproseso mo ang lamad bilang kung ito ay isang western blot.

3. Ang pangalawang antibody ay kinikilala ang pangunahing antibody? Muli, isang matigas na pagsubok. Tungkol sa tanging pagsubok na maaari mong gawin ay ang pagsubok sa lugar na binanggit sa itaas sa 2.

4. Gumagana ba ang "sistema ng pag-detect"? Depende sa paraan ng pagtuklas na iyong ginagamit maaari mong subukan ang spiking sa ilan sa mga pangalawang antibody upang makita kung ang solusyon sa pagtuklas, at din ang nagpapalit na ahente / enzyme sa pangalawang antibody, ay gumagana. Iyon ay, maaari mo bang ma-trigger ang reaksyon lamang sa pangalawang antibody?

Sa wakas, maaaring ito ay kasing simple ng isa sa mga solusyon na ginamit sa panahon ng probing ng balangkas na ginawa nang hindi tama. Halimbawa, kung ang konsentrasyon ng asin ay mali sa buffer, ito ay maaaring maging sanhi ng mga antibodies na ilalabas mula sa blot. Ang parehong mangyayari rin kung ang pH ng buffers ay hindi tama.

Ang "weirdest" na dahilan para sa isang western blot hindi gumagana na ako ay personal na nakaranas ay kapag binago namin ang supplier ng gatas pulbos ginagamit namin upang harangan ang lamad. Ang pulbos mula sa bagong tagapagtustos ay naglalaman ng phosphotyrosine phosphatase na nag-alis sa lahat ng mga grupo ng phosphate na sinusubukan nating tuklasin sa aming anti-phosphotyrosine antibody.